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Syk在不同乳腺病变组织中的表达及临床题意义

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内容提示: 复旦大学硕士学位论文Syk在不同乳腺病变组织中的表达及临床意义姓名:赵鹏申请学位级别:硕士专业:外科学(普外科)指导教师:王红鹰20090415 复旦大学临床医学七年制硕士学位论文Syk在不同乳腺病变组织中的表达及临床意义中文摘要目的:探讨纤维囊性乳腺病、癌前期病变、乳腺癌和乳腺癌旁正常组织中抑癌基因SYK的蛋白表达的差异,并比较Syk的表达与肿瘤大小、淋巴结转移、病理分期、ER、PR、p53和H ER2/neu的关系。对象和方法:用Supervi onTM 二步免疫组化检测20例纤维囊性乳腺病、16例DIN 2( 导管原位癌,中级别) 、168例浸润性导管癌和95例癌旁正常组织中Syk蛋白的表...

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复旦大学硕士学位论文Syk在不同乳腺病变组织中的表达及临床意义姓名:赵鹏申请学位级别:硕士专业:外科学(普外科)指导教师:王红鹰20090415 复旦大学临床医学七年制硕士学位论文Syk在不同乳腺病变组织中的表达及临床意义中文摘要目的:探讨纤维囊性乳腺病、癌前期病变、乳腺癌和乳腺癌旁正常组织中抑癌基因SYK的蛋白表达的差异,并比较Syk的表达与肿瘤大小、淋巴结转移、病理分期、ER、PR、p53和H ER2/neu的关系。对象和方法:用Supervi onTM 二步免疫组化检测20例纤维囊性乳腺病、16例DIN 2( 导管原位癌,中级别) 、168例浸润性导管癌和95例癌旁正常组织中Syk蛋白的表达,并用免疫组化方法检测168例乳腺癌组织中ER、PR、p53、H ER2/neu表达的情况。结果:纤维囊性乳腺病、DIN 2、乳腺癌及癌旁正常组织中Syk的表达阳性率分别为90%(18/20例)、5096(8/16例)、34.52%(58/168例)、78.95%(75/95例)。乳腺癌与纤维囊性乳腺病(X=22.84,尺O .005)、癌旁正常组织(胙47.91,尺0.005)中Syk表达率差异有显著意义。DIN 2与纤维囊性乳腺病(胙7.7887,尺O .010)、癌旁正常组织(胙4.646,尺0.05)中Syk表达率差异有显著意义。Syk的表达与肿瘤大小、淋巴结转移、病理分期、ER、PR、p53、H ER2/neu均无明显相关性。结论:Syk在纤维囊性乳腺病、癌旁正常组织、癌前期病变和乳腺癌中表达率依次降低。关键词:脾酪氨酸激酶(Syk),乳腺癌,癌前期病变,纤维囊性乳腺病,免疫组化中图分类号:R737.93 复旦大学临床医学七年制硕士学位论文Expressi onofSyki n D i fferent Brest Lesi ons andThei r Cl i ni calSi gni fi canceAbstractO bj ecti veTo eval uate the di fferences ofSyk gene expressi oni n hum anbreastfi broadenosi s、ductali ntraepi thel i al neopl asi a2、breastcancer andadj acentnorm alti ssue,and tostudythe correl ati on ofexpressi onofSyk genew i th tum orsi ze、l ym phfol l i cl e、stages、ER、PR、p53andH ER2/neu.。M ethodsIm m unohi stochem i stry( Supervi onTMm ethod) W asused to detect theexpressi onofSyk genei n 20 breast fi broadenosi s、16 duetali ntraepi thel i al neopl asi a2and 1 68breast cancer(95 adj acentnorm al ti ssue),M eanw hi l e,ER、PR、p53、HER2/neuw eredetected i n 168 breast CanCel "ti ssue w i th i m m unohi stocherni calstai ni ng.Resul ts111eposi ti veratesofSyk gene expressi onw ere 90%( 18/20) 、50%( 8/16) 、34.52%( 58/168) 、78.95%( 75/95) respecti vel yi n breast fi broadenosi s、ductali ntraepi thel i al neopl asi a2、breastcancer ti ssue andadj acentnorm al ti ssue.Theposi ti ve expressi onrate ofSykW assi gni fi cantl yl ow er i n the breast CanCerti ssue than those i n the breast fi bm adenosi s(r=22.84,P<0.005)andthose i n theadj acentnorm al ti ssue(Xe=47.91,P<0.005).Theposi ti ve expressi onrate ofSykw assi gni fi cantl yl ow er i n ductali ntraepi thel i al neopl asi a2than those i n the breastfi broadenosi s(Xe=7.7887,P<0.010)and those i n theadj acentnorm al ti ssue of breastcancer(Xe=4.646,P<0.05).W e di d not fi ndanycorrel ati onbetw een reducti on ofSyk gene expressi oni nbreast CanCer ti ssue andcl i ni copathol ogi cfactors or otherprognosti cm arkers i n ourseri esstudy.Concl usi onProgressi vel oss ofSyk geneexpressi on duri ng progressi onfromnorm al toD CI S to i nvasi ve tum or.N o correl ati on betw een reducti onofSyk gene expressi oni nbreast CanCer ti ssueandcl i ni copathol ogi cfactors or otherprognosti cm arkers.4 复.日.大学临床医学七年制硕士学位论文Keyw ordsspl een tyrosi neki nase(syk),breast cancer,precancerousl esi on,breast fi broadenosi s,l m m unohi stoehem i stry5 复旦大学临床医学七年制硕士学位论文前言乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,乳腺癌的发生是一个多因素相互作用的结果,其中包括癌基因的激活和抑癌基因的变异和缺失。现在已知的癌基因H ER2/neu的过表达与乳腺癌的复发及远处转移增加相关,并有针对性地靶向治疗( 单克隆抗体治疗) 。抑癌基因p53的突变也与乳腺癌的预后差相关。而BRCAI和BRCA2突变可以明显提高乳腺癌的发病率。SYK基因最初是由日本学者T嘶gum 等【111991年从猪脾cDN A克隆出来,其编码蛋白是一种非受体型酪氨酸激酶,命名为脾酪氨酸激酶( spl een tyrosi neki nase,Syk)。最初对Syk的研究集中在它对造血细胞尤其是免疫细胞作用的探讨,如B淋巴细胞、T淋巴细胞、血小板、自然杀伤细胞等。Sada掣2】认为,Svk基因是一种候选抑癌基因,其表达产物s)rl (的缺失会使免疫细胞发育、成熟障碍,重者会导致重症联合免疫缺陷病(severecom bi nedi m m unodefi ci ency,scn) ) ,由于机体免疫细胞的成熟障碍,机体的免疫监测会下降,从而对突变、异常增生的细胞失去免疫力,导致肿瘤的发生。Coopm an等t习在2000年报道了Syk在乳腺癌组织和正常乳腺组织的差异,这引起了人们对Syk在实体肿瘤的发生、发展过程中作用的广泛兴趣。近,L年研究表明Syk是乳腺癌细胞生长和转移中重要的抑制因子。本次研究用Supervi onTM 二步法行免疫组化检测乳腺癌、癌旁正常组织、癌前期病变、良性乳腺病变中Syk的表达情况。并分析SYK基因的表达与患者的肿瘤大小、淋巴结转移、病理分期、雌激素受体( ER) 、孕激素受体( PR) 、p53、H ER2/neu的关系。6 复旦大学临床医学七年制硕士学位论文材料与方法一、材料华山医院2008年9月"-' 2009年3月因乳腺病变而手术切除的标本。患者均为女性,其中:乳腺纤维囊性乳腺病20例,中位年龄41.5(21.0"-52.O )岁。乳腺DIN 2 16例,中位年龄47.5(36.0"-' 60.O )岁。乳腺癌168例,中位年龄53.0(21.0"-' 83.O )岁。乳腺癌组取距瘤体5cm 正常乳腺组织95例,中位年龄54.0(27.0"83.O )岁。168例乳腺癌中7l 例有淋巴结转移。I期78例,II期53例,III期37例。所有乳腺癌病例均符合下列标准:①初发病例;②一侧乳房的单发病灶;③病理类型为浸润性导管癌;④患者术前未作过放、化疗,也未作过腋窝淋巴结活检及其他手术。二、方法采用Supervi onTM 二步法行免疫组化检测。Syk单克隆抗体( 产品编号:M 0670) 及检测试剂购自上海长岛生物有限公司。操作步骤:’①用4%甲醛溶液固定24h后制作成蜡块。②以3m m 厚度切片行苏木精一伊红(HE)染色及免疫组化检查。③二甲苯脱蜡,酒精梯度水化。④热抗原修复:pH6.0 lOm m o脯檬酸盐缓冲液中煮沸lOm inX2次。⑤冷却后0.3%双氧水处理5m i n。⑥PBS洗涤2rai nX3次。滴加1;50浓度Syk一抗,室温放置60m i n。⑦PBS洗涤2m i nx 3次。加一滴检测试剂,室温放置30rai n。⑧PBS洗涤2m i nX 3次。DAB显色5"--10m i n。⑨苏木精复染,脱水,封片。7 复旦火学临床医学七年制硕:上学位论文三、结果判定采用已知的阳性片作阳性对照,用PBS代替一抗作阴性对照,以排除假阳性结果。Syk阳性细胞定位于细胞浆,通过光镜观察分析,在高倍视野( × 400)下对含棕黄色颗粒的细胞数进行计数。阳性细胞≤10%为阴性(一),>10%一-.-25%为弱阳性( +) ,>25%~50%为阳性( ++) ,>5096为强阳性( +++) 。( 一) 、( +)的定为阴性标本,( ++) 、( +++) 定为阳性标本( 见表1) 。表1 Syk表达阳性/阴性判定标准同时用免疫组化方法检测患者的ER、PR、p53、H ER2/neu的表达情况,并分析患者肿瘤大小、淋巴结转移、肿瘤分期情况。四、统计学处理多组计数资料的显著性检验采用行X列表j 硷验。规定尺O .05为差异有统计学意义。8 复旦大学临床医学七年制硕二I:学位论文结果一、Syk在肿瘤与肿瘤旁正常组织的表达比较168例浸润性导管癌中58例表达阳性,阳性率34.5%;95例癌旁正常组织中75例表达阳性,阳性率78.9%。差别有统计学差异(胙47.91,P(O .005)。乳腺癌组织较癌旁正常组织Syk表达率有明显减少( 见表2) 。二、Syk在乳腺良性组织的表达20例纤维囊性乳腺病中18例表达阳性,阳性率90%。与乳腺癌中的表达率有统计学差异(胙22.84,f(O .005)。乳腺癌组织较纤维囊性乳腺病Syk表达率有明显减少。纤维囊性乳腺病与癌旁正常组织的Syk表达率相比无统计学差异(胙0.6880,0.25<f(0.5)。尚不支持癌旁组织的Syk表达较纤维囊性乳腺病减少( 见表2) 。三、Syk在乳腺DIN 2的表达16例乳腺DIN 2中8例表达阳性,阳性率50%。与纤维囊性乳腺病相比其Syk表达率有统计学差异(X:7.7887,P(O .010)。与癌旁正常组织相比其Syk表达率有统计学差异(胙4.646,f(O .05)。Syk的表达在乳腺癌前期病变中已经有所减少,与乳腺癌中的Syk表达率相比无统计学差异(胙1.521,0.IO <P(O .25)。尚不支持乳腺癌较癌前期病变中Syk表达减少( 见表2) 。四、Syk与临床病理参数之间的关系Syk的表达与肿瘤大小、淋巴结转移及肿瘤分期均无明显相关性( 见表3) 。五、Syk与其他病理学指标之间的关系Syk的表达与肿瘤的ER、PR、p53、H ER2的表达均无明显相关性( 见表3) 。9 复.垦大学临床医学七年制硕士学位论文表2乳腺癌、癌旁正常组织、DIN 2和纤维囊性乳腺病中Syk的表达情况表3乳腺癌中Syk的表达与各临床病理学指标之间的关系10 丝l J .人学临床I必学tJ l -$IJ 顺}:学位论文图l 纤维囊性乳腺病、I) I N 2、乳腺癌及}{;:;旁II:常fl t织, , t, Syk农达I;11性/15}J 性例数HH—|]l J I\’一_■● s、’ k姐l r口¨ k⋯中图2纤维囊4' k-%腺病、癌旁J F常乳腺组织、DIN 2和乳腺癌Syk表达率的差片㈧■槲 、挺}{.人学临,末医学{二,1i 制帧十学位论文图3纤维囊性乳腺病,Syk呈阳性表达( 免疫细化Supervi onTM 法,× 200)图4纤维囊性乳腺病,Syk呈阳性表达 ( 免疫组化Supervi onTM 法,× 400) 女H 人学临『术阪学C:l $aJ 颀{:学位论文图5纤维囊性乳腺病,Syk呈阴性表达( 免疫组化Supervi onTM 法。× 200)图6纤维囊性乳腺病,Syk星阴性表达( 免疫组化Supervi onTM 法,× 400) 艇tt.人学临床医学Lt『i 制硕}j 学何沦文图7 DIN 2,Syk呈阳性表达鞴●蠹絮· ·● -(免疫甜1化Supervi onTM 法,× 200)’ ,。:箩,.~,产。。_矿’盎图8 DIN 2,Syk早阴性表达· 卜声● 。,● 、’《./∥ 。‘ ,..{。一._一.妒● ‘^· -≯7÷ 砧Zb· ,’ 注簟.j+净b‘ ,羹簟.j 。尊-★..蛰I‘●( 免疫绀l 化Supervi onTM 法,x400)¨ ~-.』-。二帮,.、岭~,..冷镰一■ ◆,..j讯j,霉.≮.‘ 复}j .人学临『术队学Lffi 制钡。}:学能沦文图9浸润性导管癌,Syk呈阴性表达 ( 免疫组化Supervi onTM 法,x400)图10没润性导管癌,Syk呈阳性表达(9a疫组化Supervi onTH 法,x400) 技Ij 人学临眯医学L印制帧fj 学化沦艾图l 1癌旁正常组织,Syk呈阳性表达A( 免疫纽化Supervi onTM 法,x200)●一图12癌旁正常组织,Syk呈阳性表达B( 免疫组化Supervi onTM 法,x200)0苎~:、 堑LJ .人学临床队学匕印制倾十学位沦文图13癌旁正常组织,Syk早阴性表达( 免疫组化Supervi onTM 法,× 200)缎● _--.__‘ -_‘ j【—:.、o≮图14癌旁正常组织,Syk星阴性表达( 免疫组化Supervi onTM 法。× 400)"k一藩~,囊慧 复旦人学临床医学七年制硕J :学位论文讨论人SYK基因定位于9号染色体q22区,Sykm RN A全长2672bp,含1个内含子和2个外显子。其表达蛋白Syk是一种非受体型酪氨酸激酶,包含629个氨基酸残基,分子量为72kD。Syk蛋白是B细胞激活信号转导过程中最重要的激酶,并被作为B细胞受体( BCR) 信号转导分子得到广泛的研究。Syk与T细胞激活中的ZAP.70属于同一蛋白酪氨酸激酶家族,其特点是包含有两个串联的SH 2结构域( Srchom ol ogy2dom m ns) ——SH 2( N ) 和SH 2( C) 以及一个体现酪氨酸激酶固有特性的激酶结构域( ki nasc) SH l 。SH 2是免疫酪氨酸受体激活基序( i m m unoreceptor tyrosi ne-basedacti vati onm oti fs,11rAM )招募的首选对象。被招募的Syk立即成为Src作用的第二个靶目标,进而可以启动B细胞活化信号转导的三条主要途径径( 磷脂酰肌醇途径、M AP激酶相关途径和磷酸肌醇3激酶途径) ,最终激活各种转录因子,使之进入细胞核内,进而使相应的基因发生转录激活出现产物的表达【4】。免疫组化是一种临床病理诊断和形态学研究中非常重要的技术和手段,可以半定量检测肿瘤组织的相关抗原。其应用抗体结合组织中特异性抗原的特殊染色。良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。整个免疫组化过程步骤较多,每步应按操作要求严格操作,脱蜡时间一定要充分。每步PBS冲洗时间、次数一定不能省略,因PBS液内含有盐,可以减少背景染色。滴加试剂时要均匀、足够,要比切片上的组织界限宽出0.05-0.35cm 防止出现边缘效应。此外,组织浸液的温度,切片烘烤的温度控制,实验操作过程中的室内温度及抗体的效价等都是影响免疫组化标记质量的重要因素。耐心细致的工作态度,标准化、规范化的操作,是完成实验的基本保证【51。Coopm an等pJ 首先发现Syk广泛的存在于人类正常乳腺组织、良性病变和低负荷肿瘤组织中,但在侵袭性乳腺癌中,Syk m RN A( 检测方法RT- PCR) 和蛋白( 蛋白质斑迹法W estern bl ot) 则表达减少或缺失。正常乳腺组织和乳腺癌组织的原位杂交实验验证了Syk在正常乳腺上皮和正常乳腺上皮细胞株M CFIO A中表达,在原位癌中表达受抑制,而在侵袭乳腺癌中表达缺失。接着他们利用裸鼠做动物实验显示,在Syk表达缺失的乳腺癌细胞中,转染野生型SYK基因,可以明显抑制肿瘤的生长和远处转移。相应的,乳腺癌细胞过度表达无激酶活性的Syk则显著提高了肿瘤的发生和生长。本次试验中乳腺癌中Syk( 蛋白) 表达阳性率[ 34.52%( 58/168例) ] 明显低于癌旁正常组织[ 78.95%( 75/95例) ]18 复旦大学临床医学七年制硕:b学位论文(舴47.91,尺0.005),明显低于纤维囊性乳腺病[90%(18/20例)](, Ie=22.84,P( O .005) 。这与乳腺癌中Syk表达缺失是完全相符的,符合抑癌基因在肿瘤中表达减少或缺失。纤维囊性乳腺病是乳腺纤维组织及上皮增生伴囊肿形成与复旧不全的一种乳腺结构紊乱的疾病。其病理形态多样,命名不一,西方学者多称纤维囊性乳腺病;在我国,囊性改变少见,多以腺体增生为主,故称乳腺增生症。世界卫生组织统称良性乳腺结构不良。本病开始由腺上皮增生,逐渐出现纤维组织增生、纤维囊性增生和纤维腺瘤形成等组织形态的病理改变。疾病可以逐步进展,也可以停止于某个阶段而自愈。纤维囊性乳腺病是一种良性病变,基本不会癌变,也不应视为癌前病变【6】【7】。导管内增生性病变或称导管上皮内肿瘤/瘤变(ductal i n仃a印i m di al noapl asi a,DIN ),发生于末梢导管-d, 叶单位(term i nal duct.10bul anm i t,TDLU)。最新的W H O的国际肿瘤学分类法(i ntcm ati onal认为DIN 是一种癌前期病变,其治疗与预后与乳腺癌迥异。DIN IA为平坦型不cl assi fi cati on of di sease for ontol ogy, ICD.O )【.7】典型性(fl at epi thel i al atypi a),是一新分类类型,由3~5层轻度不典型细胞组成,可有微小钙化。D IN IB即原先的导管上皮不典型增生( atypi calductalhyperpl asi a,ADH ),DIN IC:低级别导管原位癌(ducalcarci nom a i nsi tu,DCIS),无坏死粉刺出现,故现在诊断不写“ 癌"。DIN 2:中级别DCIS,有坏死、钙化。DIN 3:高绂别DCIS,大量坏死碎屑粉刺,与以往的DCIS粉刺型相当,具有肿瘤大、核分级高、多中心性、微浸润、易复发、缓解期短、侵袭性和癌基因高表达等特征。DCIS病人中位年龄45""65岁,有年轻化的趋势。以往多由体检发现,仅<1%,目前达10%"-15%( 占所有乳腺癌和癌前期病变的比例) 。相对危险度(rel ati veri sk,RR)为8"10。自然病程尚难确定,1/3发展为浸润癌【8】。本次实验选取DIN 2的标本作为癌前期病变组,主要是因为DIN 2的行为介于低级别DCIS和粉刺型DCIS之间,在我院癌前期患者中数目所占比例最大。选取单一病理学类型标本更可以排除其他因素对实验的影响。M oroni 等【9】通过原位杂交技术显示,在正常乳腺组织.不典型增生.原位癌.浸润性癌中,Sykm RN A是逐步减少的。他们还比较了正常乳腺组织和乳腺癌旁正常组织中Syk m RN A,发现乳腺癌旁正常组织的Sykm RN A已有减少。他们通过比较Ki 67发现Syk m RN A的表达和肿瘤细胞增殖是呈负相关的。Repana等【m 】通过免疫组化方法也得到相同的结论:Syk的表达与乳腺癌的增值和侵袭是19 复旦大学临床医学七年制硕:J :学位论文呈反比的。本实验通过比较乳腺癌、癌旁正常组织、DIN 2、纤维囊性乳腺病组织Syk表达的差异,发现Syk在纤维囊性乳腺病至癌旁正常组织至DIN 2至乳腺癌中表达阳性率依次降低。此结果与M oroni 等的结果相符,但纤维囊性乳腺病与癌旁正常乳腺组织表达率差异无统计学意义,可能与纤维囊性乳腺病病例数较少(俨20)有关;乳腺癌较DIN 2中的Syk表达阳性率降低,但次差别也无统计学意义,可能与DIN 2例数较少( 腮=16) 有关。进一步实验可以扩大纤维囊性乳腺病和DIN 2的取材数以达到预期效果。p53基因定位于17PI,是现在研究较多公认的抑癌基因,p53作为一种核转录调控因子( TA) ,能上调和下调转录水平,野生型p53能诱导细胞凋亡与DN A修复【11】。O kam ura掣12】认为Syk基因的表达是p53依赖性的,在肿瘤生成过程中p53的功能丧失会导致Syk的活性下降。本次试验中p53野生型的Syk阳性率为27.87%(17/61),突变型中Syk阳性率为38.32%(41/107)。但差别并无统计学意义( r--I.876,F>0.05) 。本次研究并不能说明Syk的表达与p53有明显关系。如果扩大样本量,可能可以得出与O kam ura相同的结论。H er-2/neu是表皮生长因子受体家族成员之一,定位于染色体17q21,是公认的癌基因。H er-2蛋白在正常的乳腺细胞( 甚至不典型增生) 中低表达,而在20%-30%的乳腺癌中可过度表达【l "。H er-2/neu基因的扩增可用荧光原位分子杂交( FISH ) 检测或Southern Bl ot检测,本次研究使用的免疫组化方法检测H er-2/neu,并不能完全反映H er-2/neu的阳性率,只能粗略比较Syk与H er-2/neu的关系。Carter等【14】认为,SYK与HER-2/neu是一对功能相反的抑癌/癌基因,H ER-2/neu的过度表达可诱导血管内皮细胞的收缩,从而使肿瘤细胞易于穿过血管屏障,易于发生转移,而Syk可作为肿瘤的抑制剂,可以抑SU H ER-2/neu收缩血管内皮细胞的作用。但本次研究并未发现Syk与H er-2/neu有明显相关性(斥4.204,自由度3,P>O .05)。Abtahi an等t巧】研究指出在胚胎时期Syk/sl p276信号途径对淋巴管发育及淋巴管和血管系统的分离有重要作用,Syk/sl p276的缺陷导致血管扩张、扭曲、数量增多及淋巴管表面标志表达增加,并形成淋巴和血液的异常分流。J i 等【16】研究发现,淋巴内皮细胞在细胞外基质中的生长、迁移和形成管道均依靠Syk/SLP76、VEGF2C/D/VEGFR23和Prox21的相互作用。Sebzda等【17】报道,循环内皮前体细胞( CEPs) 表达Syk,在携带淋巴标记( LYVE、VEGFR3) 的CEPs产生过程中需要Syk的参与。丁永斌等【I 8】研究发现有淋巴结转移的乳腺癌组织中Syk的表达阳性率要明显 复旦大学临床医学七年制硕士学位论文低于无淋巴结转移的乳腺癌( n-=40) 。W AN G等【191通过检测6l 例胃癌组织中Syk,得到相似的结论:有淋巴结转移的胃癌组织Syk表达阳性率要明显低于无淋巴结转移组。这些研究均提gSyk的表达缺失与肿瘤的淋巴结转移可能相关。本次试验中有淋巴结转移的乳腺癌中Syk的表达率30.99%(22/71),无淋巴结转移组37.11%( 36/97) 。但此差别并无明显统计学差异( r=0.6809,乃O .05) 。Toyam a等【20】通过比较90例乳腺癌组织Syk m RN A表达减少和缺失与肿瘤的大小、腋窝淋巴结转移、肿瘤的类型( 小叶来源还是导管来源) 、ER、PR、p53、HER2的关系,发现均无明显统计学意义,Gol ouh等【211通过研究ER阳性的乳腺癌也发现Syk的表达与肿瘤大小、肿瘤类型、淋巴结转移、分期及PR的状态均无关。最近本实验也获得了类似的结论。Toyaraa等【20】还通过比较乳腺癌和癌旁正常组织中Syk m RN A的表达差异,发现Syk m RN A表达减少和缺失的患者,其无瘤生存率减少,远处转移率增加,提示Syk有可能是乳腺癌独立的预后指标。Dej m ek等【22】的研究也指出Syk联合W nt.5a(一个G蛋白偶联受体)在指导乳腺癌的预后方面有独特而重要的作用。本实验中乳腺癌病例中Syk呈低表达的患者是否存在无瘤生存率减少和远处转移率增加有待于进一步随访。在自然发生的乳腺肿瘤中,目前尚未发现SYK基因突变体或同源染色体缺失,导致SYK基因沉默的确切机制仍不清楚。Yuan等【23】发现SYK基因启动子CpG岛调节序列的高甲基化,而这种高甲基化与Syk m RN A的表达缺失是强烈相关的。这提示SYK基因启动子CpG岛调节序列的高甲基化是导致Syk基因沉默的原因之一。他们进一步在Syk表达缺失的细胞中使用去甲基化试剂5一氮-2-脱氧胞苷( AZA) ,可以使Syk再表达,进而可以抑制乳腺癌细胞的侵袭力【24】。这为乳腺癌的治疗提供了一种新的思路。最近的研究表Ij fJ Syk在实体肿瘤中,如乳腺癌、胃癌【2别和肝细胞肝癌【261中具有判断预后的作用。相信随着研究的不断进展,Syk将有望像H ER2一样,成为乳腺癌新的预后指标及分子靶点。2l 复旦大学临床医学七年制硕二1:学位论文参考文献Tani guchi t Kobayashi t KondoJ,ct a1.M ol ecul arcl oni ngof aporci negene sykthat encodes a72· kDaprote:i n-tyrosi neki naseshow i ng hi gh suscepti bi l i tytoproteol ysi s[J].JBi olChcm , 1991。266( 24) :15790· 15796.SadaKTakanoL Yenagi S,et a1.Structure and Functi on ofSyk Protei n-tyrosi ne ki nase[j J】.JBi ochem(Tokyo),2001,1 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ar carci nom a[J 】.Cl i nCancer Res,2009, 15(3):812.820.23 复旦大学临床医学七年制硕二l :学位论文综述Syk与乳腺癌研究进展概述赵鹏综述王红鹰审校蛋白酪氨酸激酶(protei n tyrosi ne ki nases,PTKs)是一类催化ATP上丫.磷酸转移到蛋白酪氨酸残基上的激酶,能催化多种底物蛋白质酪氨酸残基磷酸化。PTKs与细胞的增殖、分化、迁移和凋亡有关。迄今发现的蛋白酪氨酸激酶中多数是属于致癌RN A病毒的癌基因产物【l 】。根据PTK是否存在于细胞膜受体可将其分成非受体型和膜受体型。SYK基因最初是由日本学者Tafl i gucl l i 等【2】1991年从猪脾cDN A克隆出来,其编码蛋白是一种非受体型酪氨酸激酶,命名为脾酪氨酸激酶(spl een tyrosi ne l 【i n鹤e,Syk)。最初对Syk的研究集中在它对造血细胞尤其是免疫细胞作用的探讨,如B淋巴细胞、T淋巴细胞、血小板、自然杀伤细胞等。Sada等【3】认为,SYK基因是一种候选抑癌基因,其表达产物Syk的缺失会使免疫细胞发育、成熟障碍,重者会导致重症联合免疫缺陷病(severecom bi nedi m m unodefi ci ency, scm ) ,由于机体免疫细胞的成熟障碍,机体的免疫监测会下降,从而对突变、异常增生的细胞失去免疫力,导致肿瘤的发生。Coopm an等t4】在2000年报道了Syk在乳腺癌组织和正常乳腺组织的差异,这引起了人们对Syk在实体肿瘤的发生、发展过程中作用的广泛兴趣。本文章就Syk与乳腺癌的关系的研究进展综述如下。SYK基因及蛋白的理化特点人SYK基因定位于9号染色体q22区,SYKm RN A全长2672bp,含1个内含子和2个外显子。其表达蛋Ej Syk是一种非受体型酪氨酸激酶,包含629个氨基酸残基,分子量为72 kD。Syk蛋白是B细胞激活信号转导过程中最重要的激酶,并被作为B细胞受体( BCR) 信号转导分子得到广泛的研究。Syk与T细胞激活中的ZAP.70属于同一蛋白酪氨酸激酶家族,其特点是包含有两个串联的SH 2结构域( Srchom ol ogy2dom ai ns) ——SH 2( N ) 和SH 2( C) 以及一个体现酪氨酸激酶固有特性的激酶结构域( ki nase) SH l 。SH 2是免疫酪氨酸受体激活基序( i m m unoreceptor tyrosi ne-basedacti vati onm oti fs,trAM ) 招募的首选对象。被招募N Syk立即成为Src作用的第二个靶目标。进而可以启动B细胞活化信号转导的三条主要途径径( 磷脂酰肌醇途径、M AP激酶相关途径和磷酸肌醇3激酶途径) ,最终激活各种转录因子,使之进入细胞核内,进而使相应的基因发生转录激活出现产物的表达【引。 复且大学临床医学七年制硕士学位论文Syk蛋白有两种表达形式,Syk(L)是Syk的全长形式,Syk(L)有635个氨基酸。SYK基因由于在转录过程中选择性地拼接可形成2种转录子,短转录子在功能域间域B(i nterdom ai n B,IDB) 上缺失69个碱基,所翻译的Syk蛋白较全长的蛋白[Syk(L)】少23个氨基酸,被称为Syk(S),Syk(S)缺失的氨基酸部分被称为DEL功能域。LeiW ang等[ 6] 通过研究发现在乳腺癌中Syk( L) 和Syk( S) 均有表达,而在正常组织q,Syk( S) 没有表达,通过转染Syk( L) 可以抑制肿瘤的侵袭性,而转染Syk( S) 则没有类似效果,提示Syk( L) 具有抑制肿瘤细胞侵袭性的功能。进一步研究发现乳腺癌q丁Syk( L) 可从细胞胞浆移位到细胞核内,核移位现象与Syk( L) 的抑癌功能密切相关。Syk抗肿瘤的机制Coopm an等(4J 通过在裸鼠体内转染含有Syk基因的M DA.M B-435乳腺癌细胞,发现表达Syk的乳腺癌细胞常增大,含多叶核甚至多个核,出现异常的有丝分裂,表现为有丝分裂中期出现多个纺锤体极。甚至出现x染色体和17号着丝点的数量高于正常。然后通过荧光原位杂交(fl uorescent i nsi tuhybri di zati on,FISH)分析发现异常增大的细胞是超二倍体。这些细胞在异常有丝分裂后会出现生长受阻,从而出现胞质分裂失败。Zyss等t7】研究发现出现于中心体的Syk具有催化活性,在有丝分裂间期持续表达,在有丝分裂期则因其降解。同时他也发现了转染Syk可以使细胞出现胞核大小不等、多极有丝分裂纺锤体和中心体数目增加。由于Syk磷酸化a-微管蛋白羧基末端区域包含有同调节微管装配以及功能的微管相关蛋白相互作用的位点,从而可以调节微管/微管蛋白单体的平衡。最终可以影响有丝分裂,可以认为Syk可能是通过调节微管系统来抑制肿瘤细胞的生长。N F.KB蛋白是由p65/pSO 两个亚单位构成的多效性转录因子,在恶性肿瘤中,N F.K B参与凋亡的调节、肿瘤的进展和肿瘤细胞对化疗、放疗的反应。此外,N F.KB还是一种肿瘤转移基因,最近的研究都表明其在肿瘤转移中有重要作用。N F.KB激活还可以促进U .PA的分泌。u-PA是一种丝氨酸蛋白激酶,在人体中主要作用为将纤溶酶原转变为纤维蛋白溶解酶,而纤维蛋白溶解酶可以激活Ⅳ型胶原酶,从而降解胶原及基底膜。在肿瘤发生过程中,降解基质蛋白促进了肿瘤细胞的侵袭。Du吲81对166位乳腺癌患者进行单因素分析后认为U.PA高表达者DFS、O S明显下降。Foekcns[9】研究了700名乳腺癌患者发现,U.PA阳性率在乳腺癌患者中要明显高于正常人群。M ahabel eshw arIl o】通过转染野生型Syk的M DA.M B.231乳腺癌细胞,而使酪氨酸磷酸化IKBa(i nhi bi tors ofN F.K BQ )来抑制N F.K B的活性,进而显著抑制u.PA的分泌。他还对Syl 【阳性表达的M CF. 复旦大学临床医学七年制硕士学位论文7和阴性表达的M DA.M B.231两种乳腺癌细胞株的迁移作对比,发现过表达野生型Syk能抑制M DA.M B.231细胞迁移:而将Syk特异的反义寡核苷酸转染入M CF-7细胞,能大大增加其细胞迁移速度。这显示Syk有抑制肿瘤细胞迁移的作用。Takada也连续报道了在H 202和TN F诱导的N F.K B信号途径的激活过程中,Syk发挥了关键作用【11】【12】。GRO 是一种与生长调节和炎症有关的细胞因子,Li [13】发现GRO 的表达与Syk的表达是负相关的。M DA.M B.231 cel l s@ 过度表达Syk导致了GRO tt and-' t的下降。M CF7cel l s@ 下调syk可以增力J ]GRO 的分泌。基质胶中的肿瘤侵袭性测定提示Syk的表达与GRO 的活性在肿瘤侵袭性可能的联系。进一步研究表明,在M DAM B.231细胞中,Syk表达水平与GRO 活性呈负相关。提示GRO 可能在Syk的抗肿瘤侵袭活性的作用中起到媒介作用。Syk抑SJ J N F.K B的活性,抑制了U .PA的分泌,抑SJ J GRO 的分泌及活性。这表明Syk可能是通过抑制肿瘤因子的分泌达到抑制肿瘤细胞的生长的目的。H er-2/neu是表皮生长因子受体家族成员之一,定位于染色体17q21,是公认的癌基因。H er-2蛋白在正常的乳腺细胞( 甚至不典型增生) 中地表达,而在20%-30%的乳腺癌中可过度表达【14l 。Carter【15】等认为。Syk-与HER.2/neu是一对功能相反的抑癌/癌基因,H ER.2/neu的过度表达可诱导血管内皮细胞的收缩,从而使肿瘤细胞易于穿过血管屏障,易于发生转移,而Syk可以抑$|J H ER.2/ncu收缩血管内皮细胞的作用,从而达到抗肿瘤的作用。p53基因定位-T17PI,是现在研究较多公认的抑癌基因,p53作为一种核转录调控因子( TA) ,能上调和下调转录水平,野生型p53能诱导细胞凋亡与DN A修复【161。O kam ura等【1刀认为SyI【基因的表达是p53依赖性的,在肿瘤生成过程中p53的功能丧失会导致Syk的活性下降。Abtahi an Us]研究指出在胚胎时期Syk/sl p276信号途径对淋巴管发育及淋巴管和血管系统的分离有重要作用,Syk/sl p276的缺陷导致血管扩张、扭曲、数量增多及淋巴管表面标志表达增加,并形成淋巴和血液的异常分流。J i 【19】研究发现,淋巴内皮细胞在细胞外基质中的生长、迁移和形成管道均依靠Syk/SLP76、VEGF2C/D/VEGFR23和Prox21的相互作用。Sebzda等【20l 报道,循环内皮前体细胞( CEPs) 表达Syk,在携带淋巴标’ 记( LYVE、VEGFR3) 的CEPs产生过程中需要Syk的参与。据前所述,syk( S) 因为缺失功能域间域B( i nterdom ai n B,IDB)的核定位信号 复旦大学临床医学七年制硕士学位论文而不能进入到细胞核内,亦不具备Syk(L)的抑癌特性。W ang等t6】研究发现Syk细胞核转录过程是Syk抑制肿瘤功能的限速步骤。Chakraborty等【2l 】研究乳腺癌细胞系、移植瘤和人乳腺癌组织标本发现,乏氧/有氧可导致M CF27细胞VEGF的表达显著增加,M CF27细胞转染w t Syk和m ut Syk后再暴露于乏氧/有氧环境中,W estern bl ots检测发现,w t Syk而不是rout Syk可以逆转VEGF的表达,routsyk可以使VEG F过表达。Syk激酶活性和完整的SykSH 2位点对于抑制细胞的侵袭性生长都是必需的,然而,Syk连接区的自磷酸化位点( Y348F) 的突变并不影响Syk抑制侵袭性生长的功能。Syk在乳腺癌中表达及意义Coopm 锄等【4】首先发现Syk广泛的存在于人类正常乳腺组织、良性病变和低负荷肿瘤组织中,但在侵袭性乳腺癌中,Sykm RN A( 检测方法RT.PCR) 和蛋白( 蛋白质斑迹法W estern bl ot) 则表达减少或缺失。正常乳腺组织和乳腺癌组织的原位杂交实验验i 正TSyk在正常乳腺上皮和正常乳腺上皮细胞株M CFl 0A中表达,在原位癌中表达受抑制,而在侵袭乳腺癌中表达缺失。接着他们利用裸鼠做动物实验显示,在Syk表达缺失的乳腺癌细胞中,转染野生型Syk基因,可以明显抑制肿瘤的生长和远处转移。相应的,乳腺癌细胞过度表达无激酶活性的Syk则显著提高了肿瘤的发生和生长。Thom pson等122】发现人乳腺癌细胞株如M DA2M B2468、BT474、M CF7和SKBr3中Syk高表达,而在H s578T和M A2M B2436中低表达,在BT549和M DA2M B2231、M DA2M B2435等细胞株中则检测不到。只有在典型恶性表现(高转移性和侵袭性)的乳腺细胞株q丁Syk表达缺乏。ZAP270酪氨酸激酶和Syk有高度的氨基酸序列同源性,但却不能在乳腺癌细胞株中检测到。这些结果表明,Syk表达的缺失可能与正常乳腺组织向恶性型发展有关。M oroni 等【23]通过原位杂交技术显示,在正常乳腺组织.不典型增生.原位癌.浸润性癌中,Sykm RN A是逐步减少的。他们通过比较Ki 67发现Sykm RN A的表达和肿瘤细胞增殖是呈负相关的。他们还比较了正常乳腺组织和乳腺癌旁正常组织中Sykm RN A,发现乳腺癌旁正常组织的Sykm RN A已有减少。这表示以后可能可以通过无创伤技术通过检验乳腺上皮细胞Syk( 如乳腺导管盥洗) 来早期发现乳腺肿瘤和癌前病变。为乳腺癌早期诊断提供了一种新思路。Toyarna等t24】通过比较90个乳腺癌组织和癌旁正常组织中Sykm RN A的表达27 复旦大学临床医学七年制硕:卜学位论文差异,并随访这批患者的长期转移率和生存率。发现sykm RN A表达减少和缺失的( 较正常组织小于50%) 的患者,其无瘤生存率减少,远处转移率增加。他们还比较了Sykm RN A表达减少和缺失与乳腺癌肿瘤的大小、腋窝淋巴结转移、肿瘤的类型( 小叶来源还是导管来源) 、ER、PR、p53、H ER2的关系,发现均无明显统计学意义。这提示Syk可能是一种独立的预后因子。Dej m ek等t251通过长期比较乳腺癌的生存率,发现同时表达w nt.5a( 一个G蛋白偶联受体) 和Syk的乳腺癌具有良好的预后。而仅有W nt-5a或Syk表达的乳腺癌预后较差,且他们与W m -5a和Syk均表达缺失的患者预后无统计学差异。SYK作为抑癌基因失表达的机制s假说认为一个抑癌基因的完全失活需要二次打击,这个假说几Knudson7乎在所有的人类肿瘤中被证明基本正确。长期以来,认为抑癌基因失活有两条途径:基因内突变和染色体物质丢失( 杂合性丢失LO H 或等位基因丢失) 。最近的研究已经确切证明甲基化同上述两种途径一样,是抑癌基因失活的第3条途径,而且在某些情况下是抑癌基因失活的唯一的机制【2们。DN A甲基化是指在DN A甲基转移酶( DN Am ethyl transferase,DN M T)催化下,以S.腺苷甲硫氨酸为甲基供体将甲基转移到特定碱基上的过程。DN A甲基化主要发生在G/C含量丰富的CpG二核苷酸位点(CpG岛)。在自然发生的肿瘤中,目前尚未发现Syk基因突变体或同源染色体缺失,导致SYK基因沉默的确切机制仍不清楚。Yuan[ 27】发现SYK基因启动子CpG岛调节序列的高甲基化,而这种高甲基化与Sykm RN A的表达缺失是强烈相关的。他们进一步在Syk表达缺失的细胞中使用去甲基化试剂5.氮.2.脱氧胞苷(AZA)处理后,SYK基因重新表达,并可以显著抑制乳腺癌细胞的侵袭力【2引。这提示SYK基因启动子CpG岛调节序列的高甲基化是导致SYK基因沉默的原因之一。SYK基因甲基化和基因失表达密切相关,并可能最终导致肿瘤的发生。结束语除乳腺癌外,Syk还在胃癌f291、胰腺癌【301、肝细胞癌【311、白血病【321、淋巴瘤【33】及卵巢粒层细胞瘤【34】等肿瘤中发现表达缺失。 复旦大学临床医学七年制硕士学位论文乳腺癌作为一种高发肿瘤,在全球肿瘤发病率中排名第二,在中国城市女性肿瘤发病率中排名第一,且发病人数逐年上升( 2000年新发病人数121269,2005年168013) 。而抑癌基因SYK的出现,对研究乳腺癌的发生、预防、判断预后及抗肿瘤治疗都提供了一种新的思路。但目前的研究并不能很好的阐述其抑癌的具体机制。甲基化是否是乳腺癌中SYK基因表达缺失的原因或唯一原因,现在的研究也不能阐明。去甲基化药物可以SYK基因重新表达,从而抑制乳腺癌细胞的侵袭力,这为乳腺癌治疗提供了新思路,但仍需进一步实验。相信随着我们对Syk研究的不断深入,必将为乳腺癌的防治工作提供一条新的途径。参考文献【I】LiS,Gn-al dM .1nh洳i ti on oftum orangi ognnesi s by syntheti c receptor tyrosi neki nasei nhi bi tors[J ].J D rugsDi scovery Today, 2000, 5(8):344-353.【2】Tani gnchi L Kobayashi LKondoJ , et a1.M ol ecul ar cl oni ngofaporci negene sykthat encodes a72- kD aprotei n-tyrosi neki naseshow i ng hi gh suscepti bi l i tytOproteol ysi s[J ].J Bi ol Chi n, 1991,266( 24) :15790.15796.【3】SadaKTakanotYanagi S,矗a1.Structureand Functi on ofSyk Protei n-tyrosi ne 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